De nouveaux membres du casting, ainsi que des membres déjà connus, font les voix originales, dont Aaron Pierre dans le rôle de Mufasa, John Kani dans le rôle de Rafiki, Seth Rogen dans le rôle de Pumbaa, Billy Eichner dans le rôle de Timon, Donald Glover dans le rôle de Simba, Mads Mikkelsen dans le rôle de Kiros, un lion redoutable qui a de grands projets pour sa meute, et Beyoncé Knowles-Carter dans le rôle de Nala.
C'est par Rafiki, le narrateur de MUFASA : LE ROI DES LIONS, que Kiara, la petite fille du lion de Simba et Nala, apprend l'histoire de Mufasa. Aux côtés de Rafiki, il y a bien sûr Timon et Pumbaa, avec leur style inimitable. L'histoire est racontée par retours en arrière et commence avec Mufasa en tant que lionceau orphelin, perdu et seul, jusqu'à ce qu'il fasse la connaissance de Taka, l'héritier du trône des lions.